Hjernesvulst–Transkripsjonelle og epigenetiske avhengighetene som målrettingstrategier av glioblastom

Avvikende transkripsjonsprogrammer, som en følge av dysreguleringen av ulike epeigenetiske og transkripsjonell trinn, er nøkkelen til utvikling av kreft, inkludert hjernesvulst. Vårt mål er å identifisere og karakterisere transkripsjonelle og epigenetiske regulatorer som er spesifikke for hjernekreft.

Bakgrunn

Glioblastoma multiforme (GBM) er den hyppigste og mest aggressive av de primære ondartede hjernesvulstene hos voksne. GBMs er histologisk heterogene og invasive svulster og betegnes som grad IV (mest aggressive og invasive) av WHO. Fra diagnosetidspunktet er median total overlevelse 13,9 måneder med 2 års overlevelse på 22,5% og 5-års overlevelse på 5,3%. Dette er et dystert faktum som ikke har endret seg over flere tiår. Standard behandling for GBM-pasienter er kirurgisk reseksjon etterfulgt av strålebehandling og kjemoterapi med temozolomid (TMZ). TMZ er et DNA-alkyleringsmiddel, og som flere andre kjemoterapimidler retter det seg mot DNA-replikasjonsmaskineriet til celler og fører til svært sterke bivirkninger under behandlingen. Videre gir TMZ-behandlingen bare noen få måneder ekstra med total overlevelse. Derfor er det et stort behov for å identifisere og karakterisere nye terapeutiske tilnærminger til glioblastom.

Transkripsjonell dysregulering i kreft: Gjennom det siste halvannet tiåret har sekvensering av kreftgenomer gjort det helt klart at kreftceller har mutasjoner som endrer deres epigenetiske tilstand og transkripsjonsprogram. Som et resultat har det vært et stort press for å utvikle nye terapeutiske strategier mot epigenetiske og transkripsjonelle mekanismer. Selv om det i mange år har vært kjent at genetisk modifisering av tumorspesifikke TFer stopper celleproliferasjon og medfører tumorregresjon, har det vært svært vanskelig å bringe denne kunnskapen til klinikkene. Derfor er det de siste årene vært økende fokus på kjernetranskripsjonsmaskineriet og komponenter som spesifiserer en bestemt krefttype. VI foreslår her å studere aspekter ved en annen viktig grunnleggende biologisk prosess, nemlig transkripsjon for å målrette gliomer.

Transkripsjonssykliavhengig kinase (tCDK): Det meste av cellespesifikk transkripsjon utføres av RNA polymerase II (RNAPII). Transkripsjonssyklusen til RNAPII er regulert av et sett med cyklinavhengige kinaser (CDKs) som har kritiske roller i transkripsjonsinitiering og elongering. I motsetning til cellesyklus-CDK-ene, som i stor grad er ansvarlige for cellesyklusoverganger, fosforylerer disse transkripsjonelle CDK-ene (tCDKs), som inkluderer CDK7-9 og CDK11-13, carboxy-terminaldomenet (CTD) til Pol II for effektiv transkripsjonell initiering, pausefrigjøring og elongering. CDK7-9, CDK11-13 er velkjente CDK-er med etablert aktivitet mot spesifikke aminosyrer i RNAPII CTD.

Problemstilling

Ved hjelp av en rekke nyutviklede hemmere mot tCDK-er som har forbedret målspesifisitet, har vi funnet ut at proliferasjon av gliomaceller er svært følsom for hemmere av en liten familie av tCDK-er med et stort terapeutisk vindu. Vi har videre karakterisert det spesifikke kravet til disse tCDKene i gliomaceller og identifisert molekylære mekanismer der deres selektive hemming svekker spredning av gliomaceller. Vi har også funnet ut at hemming av denne tCDK-familien fører til en rask og kraftig reduksjon i DNA-syntese. I dette prosjektet ønsker vi å undersøke og karakterisere det regulatoriske samspillet mellom transkripsjon og DNA-replikasjon i gliomaceller som er spesielt avhengig av denne familien av tCDK-er. Denne studien tar sikte på å oppnå følgende mål:

  • Etablere rollen til denne spesifikke familien av tCDK-hemmere i DNA-replikasjon
  • Etablere og karakterisere rollen til transkripsjonell nedregulering i DNA-replikasjon
  • Identifisere molekylære mekanismer som tCDK-er bidrar gjennom i regulering av DNA-replikasjon

Mål og metode

Bildet kan inneholde: rektangel, azure, organisme, gjøre, aqua.
Effekt av THZ531-behandling på DNA syntese ved bruk av EdU-inkorporering.

Vi har generert og anskaffet klinisk relevante musemodeller ved å kombinere genetiske mutasjoner som forekommer hos GBM-pasienter. In vitro studier vil hovedsakelig bli utført i Glioma-initierende celler fra mus (mGBMs) og fra pasienter (hGBM).

Ved hjelp av disse klinisk relevante GBM-cellulære modellene har vi sett på hvilken effekt en bestemt familie av tCDK-er har på cellesyklusen i gliomaceller. Vi brukte THZ531 som er en veldig potent og spesifikk hemmer mot denne familien av tCDK-er. Ved hjelp av EdU-inkorporering for å markere celler i S-fase som gjennomgår aktiv DNA-replikasjon, fant vi at etter 6-timers THZ531-behandling var det ingen EdU-inkorporering i hverken G7- eller G144-celler, noe som indikerer en inaktivering av DNA-syntese i gliomacellene. EdU-inkorporering i Hela-celler ble ikke påvirket av behandlingen.

Etter disse primære observasjonene av effekten av THZ531 på DNA-replikasjon i gliomaceller, planlegger vi å utføre følgende eksperimenter:

  • Et tidsstudium for å identifisere det tidligste tidspunktet hvor DNA-replikasjonen inaktiveres/stoppes.
  • Familien av tCDK-er har en veletablert rolle i reguleringen av DNA-skaderesponsgener. Vi vil derfor undersøke om vi ser en endring i ulike markører for DNA-skaderespons, inkludert yH2AX, 53BP1 og Rad51 foci formasjon, etter THZ531 behandling. Disse eksperimentene vil bekrefte eller utelukke om THZ531-behandling medfører en DNA-skaderespons og videre om replikasjonsstansen er avhengig av denne responsen. I begge eksperimentene vil vi bruke flowcytometri som er en kvantitativt metode.
  • Implementere DNA fiber assay for å finne ut hvilke trinn i DNA-replikasjonen som er svekket/påvirket etter THZ531-behandling.

De tre eksperimentene beskrevet ovenfor, vil bli brukt til å etablere metodene og arbeidsflyten for å undersøke effekten av THZ531-behandling eller annen behandling på DNA-replikasjon. Videre vil eksperimentene belyse tidsforløpet for påvirkningen på DNA-replikasjonen, samt belyse om DNA-skaderesponsen er involvert, eller hvilket trinn i DNA-replikasjonen som er påvirket/svekket. Resultatene generert fra disse eksperimentene vil bli brukt til å planlegge tidsforløpet for THZ531-behandlingen for å studere effekten på DNA-replikasjon på genomnivå ved hjelp av EdU-sekvensering. Ved hjelp av metodikken som er etablert her, vil vi nå målene nevnt i målseksjonen ovenfor.

Studentens arbeidsoppgaver

Vi har sett at hemming av en bestemt tCDK-familie spesifikt regulerer samspillet mellom transkripsjon og replikasjon i gliomaceller. Vårt mål er å plassere denne tCDK-familien på aksen for transkripsjon/replikasjon-regulering.

Studenten vil få kjennskap til og kunnskap i følgende eksperimentelle teknikker:

  • Arbeid med nevrale stamceller
  • Arbeid med nevrale stamceller fra pasienter
  • Bruk av CRISPR/cas9-teknologien i kreftbiologi
  • Biokjemiske metoder for å oppdage protein-protein (IP), protein-RNA (CLIP), og protein-DNA (ChIP) interaksjoner
  • Sekvenseringsteknikker med høy gjennomstrømning, som RNA-seq, ChIP-seq, SLAM-seq, CUT&RUN og CUT&Tag
  • Standard molekylærbiologiske teknikker, inkludert molekylær kloning, RT-qPCR, Western blotting

Om forskningsmiljøet

Prosjektet vil bli gjennomført ved Avdeling for Mikrobiologi, Seksjon for forskning, Oslo Universitetssykehus, Rikshospitalet i gruppen til prosjektleder dr. Deo Prakash Pandey. Dr. Pandey hadde sin postdoktor-periode i gruppen til professor Kristian Helin ved BRIC, København (Helin er nå administrerende direktør for Institute for Cancer Research, Storbritannia). Under postdoktor-perioden etablerte han metoder for modellering av glioblastoma i mus ved hjelp av nevrale stamceller fra mus og han brukte dette til å utføre flere shRNA-screeninger, in vitro og in vivo, for å identifisere nye epigenetiske regulatorer. Han har et sterkt nasjonalt og internasjonalt samarbeidsnettverk. Han ble tildelt karrierestipend fra Helse Sør-Øst i 2021 for å etablere sitt nye forskningsprosjekt om transkripsjonsavhengighet i kreft. For tiden inneholder hans prosjektgruppe en postdoktor, to talentfulle masterstudenter og en forskerlinjestudent. Det er også en tekniker knyttet til gruppen. De siste 3 årene har mer enn 10 studenter gjennomgått opplæring i gruppen hans, inkludert masteroppgavestudenter, sommerstudenter eller praktikanter. I dr. Pandeys lab vil man tilegne seg kunnskap om et nytt og spennende forskningsfelt, og man vil dra nytte av hans direkte innspill og tilstedeværelse. Alle dataene som er nevnt i dette prosjektet er generert av en forskerlinjestudent og er i ferd med å bli sendt inn som et manuskript for publisering. På grunn av dette, har vi holdt tilbake identiteten til tCDKene. Forskningstemaet har kapasitet til enkelt å ta imot 1-2 forskerlinje studenter. 

Vi tilbyr et godt arbeidsmiljø ved forskningsavdelingen til Mikrobiologisk institutt ved OUS-Rikshospitalet. Det er en internasjonal arbeidsplass, med et ungt og stimulerende miljø. Her er flere unge gruppeledere, inkludert hovedveileder for dette prosjektet, med mye ulik kompetanse. Avdelingen er godt finansiert og har en overordnet visjon om å bidra til forskning innen human sykdom og kreft.

Kontakt

Deo Prakash Pandey

Emneord: Laboratorieprosjekt, Translasjonsforskning, Celler og molekyler, Hjerne og nervesystem, Kreft, Livsvitenskap, Stamceller
Publisert 20. sep. 2021 15:14 - Sist endret 20. sep. 2021 15:23